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2019-11-01研究之前、人生之後－PCR、穆利斯與分子生物學
599 期
Author 作者
李依庭／本刊主編。
對於就讀生命科學系的人而言，分子生物學，是大學時期必修的課程。聚合酶連鎖反應，則為伴隨課程的實驗課大綱中不可或缺的存在，更是一個對於生科人而言不陌生、也不應該陌生的名詞。儘管這項技術的發明者——美國生物化學家穆利斯（Kary Mullis），於今（2019）年8月7日因肺炎逝世，享壽74歲。不過，他在1983年所提出的這項劃時代技術，卻成功開啟往後的分子生物學研究大門。
被分子生物耽誤的自由靈魂
在介紹這個於生物界中逐漸被人淡忘，不，應該是說，已太習以為常的一項技術原理之前，先來說說這位發明者。穆利斯，於1944年出生在美國北卡羅萊納州（State of North Carolina）的鄉村，在高中時期，便對科學產生興趣，畢業後遂前往喬治亞理工學院（Georgia Institute of Technology）就讀化學系。1972年，在加州大學柏克萊分校（University of California, Berkeley）取得生物化學學位後，並在堪薩斯大學醫學中心（University of Kansas School of Medicine）、加州大學舊金山分校（University of California, SanFrancisco）兩校進行博士後研究員，以研究蛋白質結構、合成蛋白質為主。
儘管中途曾離開科學研究領域，轉而到麵包店工作，1979年他再次回到科學界，任職於西特斯（Cetus）生物技術公司，進行著與DNA相關的研究，也是在這期間發明了聚合酶連鎖反應技術。當時，是一個分子生物學剛啟航的年代，科學家們開始了解「遺傳訊息」及「基因」的本質，並從微生物體中發現了限制酶（restriction enzyme）；這種神奇的酵素可以辨認特定的DNA序列，並且可以在特定位置上進行切斷。另外，一種稱為接合酶（lygase）的酵素也被發現，可以將兩段DNA黏合在一起。科學家至此有了操作基因序列的剪刀與膠水，讓這項往後稱為基因工程（genetic engineering）的技術開始有了雛型。然而，在當時，基因工程中所使用的材料具有特定意義，或者說，是具有特定序列的DNA片段，在取得與生產上仍有一定的困難。
穆利斯在希特斯公司中原本所負責的工作其實跟上述的困難有關，簡單來說，他的工作就是接單合成寡核苷酸鏈（oligo nucleotides，即小片段、長度較短的DNA片段）。寡核苷酸鏈的合成是透過化學的方式，將核苷酸一個一個堆疊而成，步驟枯燥而繁瑣。就是這種反覆性無趣的工作，讓個性桀傲的穆利斯想著如何使用更方便的方式進行DNA片段合成。根據他自身的論述，那是一個星期五的夜晚，對於工作上寡核苷酸的合成始終不順利而一籌莫展時，當他開著車、載著女友行駛在公路上，卻忽然靈光一閃，一段段的DNA片段不斷地複製的景象從腦海中跳出來。他試想，利用特定的引子（primers）以控制溫度的方式與目標DNA片段進行專一性的結合，再透過DNA聚合酶（DNA polymerase）複製，是不是就能得到大量且所需要的DNA片段？
1953年，DNA雙股螺旋結構被發表出來；1956年，參與DNA複製的DNA聚合酶I（DN Apolymerase I）被成功分離，儘管萬事皆以俱備，唯獨只欠東風。穆利斯搜尋文獻發現，過去沒有人發表過此方法，於是，他將此想法於公司中報告，雖然一開始曾遭受質疑，認為真能如此簡單就複製出DNA？所幸，這個發想順利得到公司的支持後，便開始著手進行一連串的實驗。最終，在他和研究人員的共同研究下，分別於1985和1987年將成果發表在Science和《酶學方法》（Methods of Enzymology）期刊中。1993年，穆利斯也因為這項技術的發明，與另一位發現DNA定點突變（Site-directed mutagenesis）的生物化學家史密斯（Michael Smith）共同獲得諾貝爾化學獎。
聚合酶連鎖反應原理
故事暫且說到這裡，現在，就先來說說這項技術對往後分子生物學的影響。儘管已事隔多年，但筆者仍記得大學時期分子生物學實驗期中考的第一道題目：寫出PCR的英文全名並簡述其實驗方法和原理，儘管已不再鑽研學術、醉心研究，但這記憶仍仿如昨日般猶新。
這項技術的目的，是利用酵素對特定目標的DNA片段進行專一性複製，使小樣本在短時間內擴增，循環n次反應後，產生2n個DNA。所需材料為欲被複製的模板DNA（template DNA）、界定複製起始點兩端的引子、DNA聚合酶、合成的原料去氧核苷三磷酸（dNTP）及控制反應時所需的鎂離子（Mg2+）和穩定pH值的緩衝液。
圖一：聚合酶鏈鎖反應簡圖。在 94~96°C高溫下讓雙股模板 DNA 打開（圖示1）；
在約 68°C的溫度下讓引子專一地接合上 DNA（圖示2）；
於 72°C中讓聚合酶作用，並合成出與模板 DNA 互補的新股（圖示3）；
此時第一次循環完成，新做出的兩段雙股DNA又可當作下一個循環模板， 而每次循環都能使得擴增的 DNA 片段加倍。（by Enzoklop, CC BY-SA 3.0, Wikimedia）
誠如前面所說，它的原理其實很簡單，加入上述材料後，透過加熱模板DNA使雙股螺旋變性（denaturation），分開後開始降溫至特定溫度，讓與目標DNA互補的引子能夠專一地黏合上DNA（annealing），接著再調整溫度至DNA聚合酶工作的最適溫度，使酵素結合上的引子後端，逐步沿著模板DNA合成出一股互補DNA（elongation），此時便完成第一次循環。之後，當第一個循環完成後，所做出的兩段雙股DNA又可當作下一個循環DNA的模板，使得每次循環得到的DNA片段呈倍數增加（圖一）。......【更多內容請閱讀科學月刊第599期】